原代细胞培养、传代、冻存、复苏、分离、鉴定

原代细胞培养技术


一、组织块直接培养法

1、取材，用 Hank's 液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
2、用手术剪将组织剪切成 1 mm³ 左右的小块，再用 Hank's 液洗三次。
3、将组织块转移至培养瓶，并贴附于瓶底面。
4、轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内注入适量的培养液，将培养瓶放置在 37 ℃ 恒温箱内培养。
5、放置待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37 ℃ 继续培养。

二、消化培养法

1、取材，用 Hank's 液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
2、用手术剪将组织剪切成 1 mm³ 左右的小块，再用 Hank's 液洗三次。
3、视组织块量加入酶液，37 ℃ 中消化 20～40 分钟，每隔 5 分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
4、加入 3～5 mL 培养液以终止酶消化作用（或加入相关酶抑制剂）。
5、静置 5～10 分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
6、1,000 rpm，离心 10 分钟，弃上清液。
7、加入 Hank's 液 5 mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
8、加入培养液 1～2 mL（视细胞量），血球计数板计数。
9、将细胞转移到培养瓶中，37 ℃ 下培养。

三、 器官培养

1、将不锈网做成支架形状，调整其高度至培养皿的 1/2 深度平面，在其表面放置 0.5 μm 孔径滤膜。
2、将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。
3、将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过 200 μm，水平面积不超过 10 mm²。
4、将上述准备好的培养物放入 CO₂ 培养箱，并加注氧气调整氧分压，最好到 90%。
5、培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。
6、上述可进行器官培养 1～3 周，每 2～3 天换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。
 

原代细胞传代技术


一、贴壁细胞的消化法传代

1、吸除或倒掉瓶内旧培养液。
2、加入 1 mL 左右消化液（胰蛋白酶或与 EDTA 混合液）轻轻摇动培养瓶，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3、消化 2～5 分钟后把培养瓶放置在显微镜下进行观察，发现原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时，弃去消化液，加入培养液终止消化。
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置 37 ℃ 培养箱中继续培养。第二天观察贴壁生长情况。

二、悬浮细胞的传代

1、直接传代
① 让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉 1/2～2/3。
② 用吸管吹打形成细胞悬液后，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置 37 ℃ 培养箱中培养。

2、离心法传代
① 将细胞连同培养液一并转移到离心管内，离心 800-1,000 rpm，5 分钟。
② 去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液。
③ 将细胞悬液分别接种到另外两到三个培养瓶中，置 37 ℃ 培养箱中培养。

 

原代细胞冻存技术


1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。
2、贴壁细胞需用 0.25% 胰酶常规消化将细胞消化下来，将细胞悬液收集至离心管中。
3、1,000 rpm 离心 5 分钟，弃上清液。
4、沉淀加含 DMSO 的培养液，计数，调整至（1-10）×10⁶/mL。
5、将悬液分至冻存管中，每管 1 mL。
6、密封冻存管，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
7、用记号笔标明细胞种类，冻存日期。
8、按下列顺序降温：室温→4 ℃（20 分钟〕→冰箱冷冻室（30 分钟）→超低温冰箱（-80 ℃ 过夜）→液氮。

 

原代细胞复苏技术


1、取出细胞，迅速放入 37 ℃ 温水中快速解冻。
2、吸出细胞悬液，并加 10 倍以上培养液。
3、1,000 r/分钟离心 5 分钟，去除上清。
4、用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入 37 ℃ CO₂ 培养箱静置培养。
5、镜检细胞贴壁能力。次日更换一次培养液，继续培养。

 

原代细胞鉴定技术


一、形态学鉴定

1、在倒置显微镜中直接观察活细胞的形态学特征
2、细胞染色检查 ：
a) 将无菌玻片置于细胞培养皿中，加细胞悬液后培养；
b) 待细胞长满玻片后取出，用 PBS 清洗，之后放于载玻片上，待其自然干燥；
c) 用 PBS/甲醇（1:1）固定 15 分钟；
d) 弃固定液，加合适的染色液染色；
e) 染色完毕后用清水洗净，置于空气中干燥，
f) 干燥后，用二甲本透明，光学树脂封片后观察。

二、免疫组织细胞化学鉴定

1、将无菌的盖玻片置于细胞培养皿中，将细胞悬液接种于培养皿中进行细胞爬片；
2、PBS  清洗标本 3 次，各 1 分钟；
3、4% 多聚甲醛固定 15 分钟；
4、置于空气中干燥；
5、PBS 清洗标本 3 次，各 2 分钟；
6、0.5% Triton X-100  孵育 1 次 20 分钟；
7、PBS 清洗标本 3 次，各 2 分钟；
8、3% H₂O₂  孵育 15 分钟；
9、DPBS  清洗标本 3 次，各 2 分钟；
10、封闭血清孵育（5%  正常二抗血清 DPBS 液 20 分钟）
11、一抗孵育，4 ℃ 过夜或 37 ℃ 60 分钟；
12、PBS 清洗标本 3 次，各 5 分钟；
13、二抗工作液孵育（湿盒）37 ℃ 30 分钟；
14、PBS 清洗标本 3 次，各 5 分钟；
15、C 液（湿盒）37 ℃ 30 分钟；
16、PBS 清洗标本 3 次，各 5 分钟；
17、用显色液进行显色；
18、蒸馏水洗涤 2 次 1 分钟；
19、苏木素复染 1 分钟；
20、清水洗涤 30 分钟；
21、光学树脂封片后观察。
 

原代细胞分离技术


取人或动物体内（或胚胎）的组织，将其剪碎至 1 mm³ 的组织块，再采用的如下方法进行分离培养：
 

一、悬浮细胞的分离方法


1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1,000 rpm/分钟离心 5 分钟。
2、去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的 PBS 清洗后  1,000 rpm/分钟离心 5 分钟。此步重复两次。
3、用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养。
4、如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。

二、实体组织材料的分离方法
 

（一）机械分散法


1、纤维成分很少的脑组织，部分胚胎组织，用剪刀剪碎至 1 mm³ 的组织块。
2、用 PBS 清洗两次后
①用吸管吹打，分散组织细胞。
②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出。
③或在不锈钢纱网内用钝物（注射器钝端）压挤使细胞从网孔中压挤出。
3、收集细胞转入离心管中，1,000 rpm/分钟离心 5 分钟。
4、去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。
 

（二）消化分离法


1、酶消化分离法（过夜冷消化法）
①细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用 Hanks 液清洗组织三次，剪成碎块大小为 4 毫米左右。
②再用 Hanks 液洗 2～3 次以除去血球和脂肪组织。
③加入 0.25% 的胰蛋白酶，摇匀后放 4 ℃ 过夜。
④次日再用 Hanks 液洗涤，弃去上清，共洗 2～3 次。
⑤加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。

2、非酶消化法（EDTA  消化法）
①把组织块剪碎，呈 1 mm³ 大小的组织块。
②将碎组织块在平皿中用无钙镁 PBS 洗 2～3 次。
③加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或 EDTA）于 37 ℃ 水浴中作用适当时间（中间可轻摇 1～2 次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。
④弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤 2～3 次后，加入wan全培养基。
⑤用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。

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